P15 - Label-freier Nachweis von miRNA mit DNA-Biosensoren auf der Basis einer Quarzmikrowaage

Event

16. Dresdner Sensor-Symposium 2022
2022-12-05 - 2022-12-07
Dresden

Band

Poster

Chapter

(Bio-)Medizinische Sensorik

Author(s)

P. Rahimi, S. Falahi, Y. Joseph, M. Rezvani Amin - Institut für Elektronik- und Sensormaterialien, Freiberg/D

Pages

120 - 123

DOI

10.5162/16dss2022/P15

ISBN

978-3-9819376-7-1

Price

free

Abstract

Krebs ist eine der häufigsten Todesursachen weltweit. Bis 2040 wird die Zahl der jährlichen Krebsneuerkrankungen voraussichtlich auf 29,5 Millionen und die Zahl der krebsbedingten Todesfälle auf 16,4 Millionen ansteigen. Leberkrebs ist weltweit die sechsthäufigste Krebserkrankung, aber die zweithäufigste Krebstodesursache mit jährlich mehr als 700.000 Todesfällen. Die hohe Mortalitätsrate von Leberkrebs ist darauf zurückzuführen, dass es im Frühstadium keine Symptome gibt. Daher wird Leberkrebs in der Regel erst spät im Krankheitsverlauf diagnostiziert. Die Diagnose wird in der Regel durch Ultraschall, Computertomographie (CT) oder Magnetresonanztomographie (MRT) gestellt. Eine zuverlässige Erkennung von Leberkrebs im Frühstadium ist ein entscheidender Schritt, um dessen hoher Mortalitätsrate entgegenzukommen. In den letzten Jahren haben sich der Nachweis und die Analyse von Krebs-Biomarkern als wirksames Instrument zur Krebsvorsorge, Diagnose, Prognose und Behandlung etabliert. Biomarker sind Biomoleküle in den Geweben und Körperflüssigkeiten des Menschen, deren Werte sich bei der Entwicklung abnormaler Zustände und verschiedener Krankheiten wie Krebs verändern. Zahlreiche Biomoleküle wurden als Biomarker für Leberkrebs in Betracht gezogen unter anderem Nukleinsäuren, Proteine, Saccharide, Metabolite sowie größere biologische Einheiten, wie z.B. ganze Tumorzellen. MicroRNAs (miRNAs) sind eine Klasse von nicht-kodierenden Genen, die als RNA-Sequenzen von etwa 22 Nukleotiden Länge transkribiert werden. Das abnorme Expressionsmuster der miRNA trägt zur Krebsentstehung und -progression bei. Für den Nachweis von miRNA wurden bereits viele verschiedene Methoden entwickelt, z. B. Northern Blotting, Microarray, und quantitative Polymerasekettenreaktion mit reverser Transkriptase. Trotz der angemessenen analytischen Leistung haben diese Techniken entscheidende Nachteile, wie z. B. einen hohen Zeitaufwand, ein großes Probenvolumen und teure Geräte. Daher ist die Entwicklung neuer, zuverlässiger und kostengünstiger Plattformen für das miRNA-Screening von entscheidender Bedeutung. DNA-basierten Biosensoren ermöglichen eine schnelle und selektive Identifikation von miRNAs. Verschiedene DNA-basierten Biosensoren wie elektrochemische, optische und elektromechanische Biosensoren wurden bereits umfassend für den Nachweis von krebsrelevanten miRNAs entwickelt, um Krebs in einem frühen Stadium zu diagnostizieren. Elektromechanische Biosensoren sind interessante Analysegeräte, die das Grundprinzip einer Antwort auf eine Veränderung der Masse nutzen. Ein Biosensor, der auf der Quarzkristall-Mikrowaagen-Technologie (QCM) basiert, ist eine der häufigsten markierungsfreien elektromechanischen Biosensing-Plattformen für den Nachweis einer breiten Anzahl von Biomolekülen. Darüber hinaus bieten QCM-Biosensing-Assays eine hohe Empfindlichkeit und einen kurzen Nachweisprozess, was sie für die Entwicklung neuartiger Einweg-Diagnoseinstrumente attraktiv macht. QCM-Biosensoren bestehen aus einem piezoelektrischen Kristall (Quarz), der mit einer Elektrode beschichtet ist, und ihre Funktion basiert auf der Änderung der Resonanzfrequenz des Quarzes als Reaktion auf die Anlagerung eines Zielmoleküls. DNA-Sonden können auf QCMSensoroberflächen immobilisiert werden. Die Zugabe einer miRNA-haltigen Probe und die anschließende Hybridisierung von DNA/miRNA führt zu einer Massenanlagerung an der Kristalloberfläche und erzeugt eine Frequenzantwort. Die Immobilisierung der DNA Sonde auf der QCM-Sensoroberfläche ist dabei ein entscheidender Schritt bei der Herstellung dieser DNA-Biosensoren. Die Silanisierung ist dafür ein einfacher, attraktiver und relativ kostengünstiger Ansatz zur kovalenten Modifizierung der Sensoroberfläche. Silan-Kopplungsmittel haben verschiedene funktionelle Gruppen (z. B. Amin-, Carboxyl- und Epoxygruppen), reagieren leicht mit hydroxylierten (OH) Oberflächen und bieten damit eine ideale Plattform für die Anbringung von Biomolekülen. In dieser Arbeit wurde die Indium-Zinnoxid (ITO)-Elektrode des QCM-Sensors zunächst über eine O2-Plasmabehandlung hydroxyliert und dann mit 5,6-Epoxyhexyltriethoxysilan (EHTES) als Epoxy-Kopplungsmittel funktionalisiert, um den NH2-terminierten DNA-Strang über eine Epoxy-Ringöffnungsreaktion durch nukleophilen Angriff der NH2-Gruppen zu immobilisieren. Nach erfolgreicher Immobilisierung der DNA-Sonde auf der ITO-Oberfläche ist der Sensor bereit für die Detektion von Hybridisierungsereignissen der komplementären miRNA-122 (als Leberkrebs- Biomarker), die zu einer messbaren Frequenzänderung führen. Hydroxylierung, Silanisierung, Immobilisierung von NH2- DNA und Hybridisierung von miRNA auf der Oberfläche der ITO-Elektrode sind in Schema 1 dargestellt.

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